器材與試劑 
        干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素. 純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計(jì)、磁力攪拌器等
具體步驟
1. 水： 
細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水.
2. PBS (也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)： 
　　主要用于免疫組化染色時(shí)組織或細(xì)胞的漂洗
　　溶解定容：將藥品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動(dòng)，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容**1000ml，搖勻即成新配制的PBS溶液。用HCl或NaOH調(diào)PH到7.4。
　　移入溶液瓶?jī)?nèi)待消毒：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。 
3. 胰蛋白酶溶液：
       胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對(duì)胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時(shí)間有關(guān)，在pH為8.0、溫度為37℃時(shí)，胰酶溶液的作用能力**強(qiáng)。使用胰酶時(shí)，應(yīng)把握好濃度、溫度和時(shí)間，以免消化過(guò)度造成細(xì)胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時(shí)應(yīng)選用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。終止消化時(shí)，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對(duì)細(xì)胞的作用。 
　　稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25％，用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調(diào)PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。攪拌混勻，置于4℃內(nèi)過(guò)夜。 
　　用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺(tái)內(nèi)用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20℃保存以備使用。 
4. 0.05％胰蛋白酶－0.02%EDTA溶液
　　稱取胰蛋白酶粉末（1：250） 0.05g，EDTA 0.02g，加入PBSA 100ml，0.22um微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝，于－20℃保存。
5. 青、鏈霉素溶液： 
　　所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘滅菌。 具體操作均在超凈臺(tái)內(nèi)完成。青霉素是80萬(wàn)單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬(wàn)單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬(wàn)單位。 分裝于－20℃保存。使用時(shí)溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度**終為100單位/ml。
6. RPMI1640： 
　　溶解、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次(沖洗液一并加入培養(yǎng)基中),充分?jǐn)嚢?*粉劑全部溶解,并按照包裝說(shuō)明添加一定的藥品.然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml, 使青鏈霉素的濃度**終各為100單位/ml。然后用二氧化碳或碳酸氫鈉調(diào)PH到7.2左右。**后定容**1000ml，搖勻。 
　　安裝蔡式濾器：安裝時(shí)先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。 
　　抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過(guò)濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺(tái)內(nèi)過(guò)濾。 
　　分裝：將過(guò)濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶?jī)?nèi)置于4℃冰箱內(nèi)待用。 
　　使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃時(shí)兩周有效）。 
7. 血清的滅活： 
　　細(xì)胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買來(lái)的血清要在56℃水浴中滅活30分鐘后，再經(jīng)過(guò)抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。 
8. HEPES溶液： 
　　HEPES的化學(xué)全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長(zhǎng)時(shí)間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEPES即可達(dá)到緩沖能力。 
1mol/L HEPE緩沖液配制方法如下： 
　　準(zhǔn)確稱取HEPTS 238.3g，加入新鮮三蒸水定容**1L。0.22um微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝后4℃保存。 
　　注意：因?yàn)楝F(xiàn)在市售HEPES為約10g包裝的小瓶，所以可根據(jù)實(shí)際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內(nèi)HEPES的終濃度仍然為20m mol/L 。如：稱取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，過(guò)濾除菌后可完全（20ml）加入1L培養(yǎng)液中，或者每100ml培養(yǎng)液中加入2ml即可。 
9. 谷氨酰胺： 
　　合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏要導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)不良甚**死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4℃#p#分頁(yè)標(biāo)題#e#下放置1周可分解50％，故應(yīng)單獨(dú)配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱中儲(chǔ)存2周以上時(shí)，應(yīng)重新加入原來(lái)的谷氨酰胺。 
　　一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為1～4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液貯存，用時(shí)加入培養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加**100ml即配成200mmol/L的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅^(guò)濾除菌，分裝小瓶，-20℃保存，使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液。 
10. 肝素溶液的配制： 
　　含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中**終濃度為50ug/ml。因?yàn)楝F(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0.56克/瓶，配制時(shí)，可將其溶于100ml三蒸水中，定容，過(guò)夜，然后過(guò)濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為??℃ 。使用時(shí)，向100ml培養(yǎng)液中加入1ml（精確可加入0.9ml）即可。 #p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
11. Ⅰ型膠原酶： 
　　0.1％Ⅰ型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因?yàn)棰裥湍z原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過(guò)濾，因此可以用蔡式濾器過(guò)濾除菌。分裝入10ml小瓶-20℃保存。 
12. 明膠溶液： 
　　因?yàn)槊髂z難于過(guò)濾，所以配制0.1％明膠溶液必須用無(wú)菌的PBS配制。所以制備過(guò)程中必須要注意無(wú)菌操作。shou要的問(wèn)題是如何無(wú)菌準(zhǔn)確稱量0.1克（配成100ml溶液）—即解決無(wú)菌分裝藥品的問(wèn)題。其次要注意即使是01.的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過(guò)夜放置，然后無(wú)菌操作分裝入50ml小瓶中，4℃保存。 
13. Hanks液：
       稱取KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4.H2O  0.06g，加H2O** 1000ml 
　　注：Hanks液可以高壓滅菌。分裝于4℃下保存。
14. D-hanks液：
　　1液：NaCL:8.00g/L，KCL : 0.04g/L，Na2HPO4.2H2O:0.06g/L，KH2PO4:0.06g/L，配500毫升；
　　2液：NaHCO3：0.35g/L，配100毫升；
　　3液：酚紅：0.02g，用數(shù)滴NaHCO3溶解酚紅
　　將2，3液移入1液中。定容到1000毫升 PH值是7.4左右。分裝于4℃下保存。
15. Giemsa染液： 
　　稱Giemsa粉末0.5克，加幾滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油總量為33ml）。56℃中保溫90~120分鐘。加入33ml甲醇，置棕色瓶中保存，此為Giemsa原液。 使用時(shí)按要求用PBS稀釋。一般稀釋10倍。  

器材與試劑          干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素. 純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計(jì)、磁力攪拌器等 具體步驟 1. 水：  細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水. 2. PBS (也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：  　　主要用于免疫組化染色時(shí)組織或細(xì)胞的漂洗 　　溶解定容：將藥品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動(dòng)，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容**1000ml，搖勻即成新配制的PBS溶液。用HCl或NaOH調(diào)PH到7.4。 　　移入溶液瓶?jī)?nèi)待消毒：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。  3. 胰蛋白酶溶液：        胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對(duì)胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時(shí)間有關(guān)，在pH為8.0、溫度為37℃時(shí)，胰酶溶液的作用能力**強(qiáng)。使用胰酶時(shí)，應(yīng)把握好濃度、溫度和時(shí)間，以免消化過(guò)度造成細(xì)胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質(zhì)克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時(shí)應(yīng)選用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。終止消化時(shí)，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對(duì)細(xì)胞的作用。  　　稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25％，用電子天平準(zhǔn)確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調(diào)PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。攪拌混勻，置于4℃內(nèi)過(guò)夜。  　　用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺(tái)內(nèi)用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20℃保存以備使用。  4. 0.05％胰蛋白酶－0.02%EDTA溶液 　　稱取胰蛋白酶粉末（1：250） 0.05g，EDTA 0.02g，加入PBSA 100ml，0.22um微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝，于－20℃保存。 5. 青、鏈霉素溶液：  　　所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘滅菌。 具體操作均在超凈臺(tái)內(nèi)完成。青霉素是80萬(wàn)單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬(wàn)單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬(wàn)單位。 分裝于－20℃保存。使用時(shí)溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度**終為100單位/ml。 6. RPMI1640：  　　溶解、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次(沖洗液一并加入培養(yǎng)基中),充分?jǐn)嚢?*粉劑全部溶解,并按照包裝說(shuō)明添加一定的藥品.然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5ml, 使青鏈霉素的濃度**終各為100單位/ml。然后用二氧化碳或碳酸氫鈉調(diào)PH到7.2左右。**后定容**1000ml，搖勻。  　　安裝蔡式濾器：安裝時(shí)先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。  　　抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過(guò)濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺(tái)內(nèi)過(guò)濾。  　　分裝：將過(guò)濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶?jī)?nèi)置于4℃冰箱內(nèi)待用。  　　使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃時(shí)兩周有效）。  7. 血清的滅活：  　　細(xì)胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買來(lái)的血清要在56℃水浴中滅活30分鐘后，再經(jīng)過(guò)抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。  8. HEPES溶液：  　　HEPES的化學(xué)全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長(zhǎng)時(shí)間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50mmol/L，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEPES即可達(dá)到緩沖能力。  1mol/L HEPE緩沖液配制方法如下：  　　準(zhǔn)確稱取HEPTS 238.3g，加入新鮮三蒸水定容**1L。0.22um微孔濾膜過(guò)濾除菌，分裝后4℃保存。  　　注意：因?yàn)楝F(xiàn)在市售HEPES為約10g包裝的小瓶，所以可根據(jù)實(shí)際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內(nèi)HEPES的終濃度仍然為20m mol/L 。如：稱取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，過(guò)濾除菌后可完全（20ml）加入1L培養(yǎng)液中，或者每100ml培養(yǎng)液中加入2ml即可。  9. 谷氨酰胺：  　　合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏要導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)不良甚**死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4℃下放置1周可分解50％，故應(yīng)單獨(dú)配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱中儲(chǔ)存2周以上時(shí)，應(yīng)重新加入原來(lái)的谷氨酰胺。  　　一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為1～4mmol/L。可以配制200mmol/L谷氨酰胺液貯存，用時(shí)加入培養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加**100ml即配成200mmol/L的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅^(guò)濾除菌，分裝小瓶，-20℃保存，使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液。  10. 肝素溶液的配制：  　　含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中**終濃度為50ug/ml。因?yàn)楝F(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0.56克/瓶，配制時(shí)，可將其溶于100ml三蒸水中，定容，過(guò)夜，然后過(guò)濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為??℃ 。使用時(shí)，向100ml培養(yǎng)液中加入1ml（精確可加入0.9ml）即可。  11. Ⅰ型膠原酶：  　　0.1％Ⅰ型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因?yàn)棰裥湍z原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過(guò)濾，因此可以用蔡式濾器過(guò)濾除菌。分裝入10ml小瓶-20℃保存。  12. 明膠溶液：  　　因?yàn)槊髂z難于過(guò)濾，所以配制0.1％明膠溶液必須用無(wú)菌的PBS配制。所以制備過(guò)程中必須要注意無(wú)菌操作。shou要的問(wèn)題是如何無(wú)菌準(zhǔn)確稱量0.1克（配成100ml溶液）—即解決無(wú)菌分裝藥品的問(wèn)題。其次要注意即使是01.的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過(guò)夜放置，然后無(wú)菌操作分裝入50ml小瓶中，4℃保存。  13. Hanks液：

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       稱取KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖1.0g，Na2HPO4.H2O  0.06g，加H2O** 1000ml 
　　注：Hanks液可以高壓滅菌。分裝于4℃下保存。
14. D-hanks液：
　　1液：NaCL:8.00g/L，KCL : 0.04g/L，Na2HPO4.2H2O:0.06g/L，KH2PO4:0.06g/L，配500毫升；
　　2液：NaHCO3：0.35g/L，配100毫升；
　　3液：酚紅：0.02g，用數(shù)滴NaHCO3溶解酚紅
　　將2，3液移入1液中。定容到1000毫升 PH值是7.4左右。分裝于4℃下保存。
15. Giemsa染液： 
　　稱Giemsa粉末0.5克，加幾滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油總量為33ml）。56℃中保溫90~120分鐘。加入33ml甲醇，置棕色瓶中保存，此為Giemsa原液。 使用時(shí)按要求用PBS稀釋。一般稀釋10倍。   1 冷凍管應(yīng)如何解凍？ 
取出冷凍管后， 須立即放入37 °C 水槽中快速解凍， 輕搖冷凍管使其在1 分鐘內(nèi)全部融化， 并注意水面不可超過(guò)冷凍管蓋沿， 否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí)， 必須注意安全， 預(yù)防冷凍管之爆裂。

2 細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí)， 是否應(yīng)馬上去除DMSO？ 
除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO 敏感之細(xì)胞外， jue大部分細(xì)胞株（包括懸浮性細(xì)胞）， 在解凍之后， 應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中， 待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附之問(wèn)題。

3 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基？ 
不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基， 若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基， 細(xì)胞大都無(wú)法立即適應(yīng)， 造成細(xì)胞無(wú)法存活。

4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類？ 
不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源， 所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來(lái)自不同物種的血清， 在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無(wú)法存活。

5 何謂FBS, FCS, CS, HS ? 
FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯(cuò)誤的使用字眼， 請(qǐng)不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。

6 培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用5 % 或10% CO2？或根本沒(méi)有影響？ 
一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統(tǒng)， 而培養(yǎng)基中NaHCO3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的CO2 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用10 % CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3 為每公升1.5 g 時(shí)， 則應(yīng)使用5 % CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。

7 何時(shí)須更換培養(yǎng)基？ 
視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定， 或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時(shí)間，按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。
8 培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？
除于特殊篩選系統(tǒng)中外， 一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下， 培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。