問題1：培養液pH 值變化太快
可能原因
（1）CO2 張力不對
（2）培養瓶蓋擰得太緊
（3）NaHCO3 緩沖系統緩沖力不足
（4）培養液中鹽濃度不正確
（5）細菌、酵母或真菌污染
建議解決方法
（1）按培養液中NaHCO3 濃度增加或減少培養箱內CO2 濃度，2.0g/L 到3.7g/L 濃度NaHCO3 對應CO2 濃度為5％ 到10％。
（2）松開瓶蓋1/4 圈。
（3）改用不依賴CO2 培養液。加HEPES 緩沖液**10 到25mM 終濃度。
（4）在CO2 培養環境中改用基于Earle′s 鹽配制的培養液，在大氣培養環境中培養改用Hanks 鹽配制的培養液。
（5）丟棄培養物，或用抗生素除菌。
問題2：培養液出現沉淀，但pH值不變
可能原因
（1）洗滌劑清洗后殘留有磷酸鹽，將培養基成分沉淀下來
（2）冰凍保存培養液
建議解決方法
（1）用去離子水反復沖洗玻璃器皿，然后滅菌。
（2）將培養液加熱到37℃，搖動使其溶解如沉淀仍然存在，丟棄培養液。
問題3：培養液出現沉淀， 同時pH 發生變化
可能原因
細菌或真菌污染
建議解決方法
丟棄培養物，或用抗生素除菌。
問題4：培養細胞不貼壁
可能原因
（1）胰蛋白酶消化過度
（2）支原體污染
（3）培養瓶瓶底不干凈
（4）培養液pH值過堿（NaHCO3分解）
（5）消化液或培養液配制錯誤、過期儲存、儲存不當
（6）細胞老化（如傳代前細胞已匯合導致失去貼附性）
（7）接種細胞起始濃度太低或太高
建議解決方法
（1）縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度。
（2）分離培養物，檢測支原體。清潔支架和培養箱。如發現支原體污染，丟棄培養物。
（3）注意刷洗，或換用一次性塑料培養瓶
（4）使用無菌醋酸溶液調整pH值或充入無菌CO2（將培養液敞口放入培養箱也可）
（5）重新配置消化液或培養液
（6）啟用新的保種細胞
（7）調節**佳接種細胞濃度
問題5：懸浮細胞成簇
可能原因
（1）培養液中含鈣、鎂離子
（2）支原體污染
（3）蛋白酶過度消化使得細胞裂解釋
（4）DNA污染
建議解決方法
（1）用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細胞，輕輕吹吸細胞獲得單細胞懸液。
（2）分離培養物，檢測支原體。如發現支原體污染，丟棄培養物。
（3）用DNase I 處理細胞。
問題6：原代細胞培養物污染
可能原因
原代培養組織在進入培養前已污染
建議解決方法
培養前用含高濃度抗生素的平衡鹽溶液反復沖洗組織。
問題7：培養細胞生長減慢
可能原因
（1）由于更換不同培養液或血清
（2）培養液中一些細胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞。
（3）培養物中有少量細菌或真菌污染
（4）試劑保存不當
（5）接種細胞起始濃度太低
（6）細胞已老化
（7）支原體污染
建議解決方法
（1）比較新培養液與原培養液成分，比較新血清與舊血清支持細胞生長實驗。讓細胞逐漸適應新培養液。
（2）換入新鮮配制培養液，或補加谷氨酰胺及生長因子。
（3）用無抗生素培養液培養，如發現污染，丟棄培養物。或用抗生素除菌。
（4）血清需保存在-5℃ 到-20℃。培養液需在2－8℃避光保存。含血清完全培養液在2-8℃保存，并在2 周內用完。
（5）增加接種細胞起始濃度。
（6）換用新的保種細胞。
（7）分離培養物，檢測支原體。清潔支架和培養箱。如發現支原體污染，丟棄培養物。
問題8：培養細胞死亡
可能原因
（1）培養箱內無CO2
（2）培養箱內溫度波動太大
（3）細胞凍存或復蘇過程中損傷
（4）培養液滲透壓不正確
（5）培養液種有毒代謝產物堆積
（6）更多原因參考問題4和問題7
建議解決方法
（1）檢測培養箱內CO2
（2）檢查培養箱內溫度
（3）取新的保存細胞種
（4）檢測培養液滲透壓。注意：大多數哺乳動物細胞能耐受滲透壓為260 – 350 mOsm/kg。加入額外試劑如HEPES或藥物都有可能影響培養液滲透壓。
（5）換入新鮮培養液
（6）更多解決方法參考問題4和問題7
 
 
 
培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長。總之，**MEM做粘附細胞培養、RPMI- 1640做懸浮細胞培養，各種目的無血清培養的**是AIM V培養基（SFM）

2.為什么要熱滅活血清？

加熱可以滅活補體系統。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在進行免疫學研究、培養ES細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。

3.L－谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎？它在溶液中不穩定嗎？

L－谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后，L－谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L－谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有**終確定。L－谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。

4.GlutaMAX-I是什么？培養細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩定？#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#

GlutaMAX-I二肽是L－谷氨酰胺的衍生物，將其不穩定的α－氨基用L－丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L－谷氨酰胺供利用。

GlutaMAX-I二肽非常穩定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I二肽溶液有**小的降解，如果在相同條件下，L－谷氨酰胺幾乎完全降解。

5.為什么培養基中可以省去加酚紅？

酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應，培養細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養基。

6.如何用臺盼蘭計數活細胞？

用無血清培養基把細胞懸液稀釋到200－2000個/毫升，在0.1毫升的細胞中加入0.1毫升的0.4％的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數分鐘后，用血球計數板計數細胞。活細胞排斥臺盼蘭，因而染成藍色的細胞是死細胞。

7.如何消除組織培養的污染？

重要的培養污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。shou先，確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。

高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。

下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟:

1 在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞，稀釋到常規細胞傳代的濃度。

2 分散細胞懸液到多孔培養板中，或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。

3 每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現空泡，匯合度下降和變圓。

4 確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2－3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2－3代。

5 在無抗生素的培養基中培養細胞一代。

6 重復步驟4。

7 在無抗生素的培養基中培養4－6代，確定污染是否以已被消除。

8.培養基中丙酮酸鈉的作用是什么？

丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源。盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

9.為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現沉淀？

GIBICO的胎牛血清 沒有預老化，儲存在2－8℃時，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應該不會影響血清的質量。推薦在－20℃儲存胎牛血清，避免反復凍融。

10.目錄上說，Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）要在空氣中使用，不需要CO2培養箱。原因是什么？Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）和Earle’s平衡鹽溶液（EBS）有什么本質的功能差別？

HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，碳酸氫鈉的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO2 中，溶液會變堿，Hanks液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在 CO2培養箱中保存組織，需要用Eagles液。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。

11.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差別?

Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清執行的所有的標準檢驗程序，而且除了這些標準檢測，Certified胎牛血清還有如下一些附加的檢測：

End-Point Determination of Endotoxin Content
噬菌體檢驗
生物化學檢測
激素的檢測
血紅蛋白檢測
Sf9 細胞生長促進及方法學檢測

12.二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？

二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養基中所有的二價離子。

13.制備 lipid-DNA的方法會影響轉染效率嗎？

是的。對于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀釋試劑在100μl OPTI-MEM中，稀釋DNA在100μl OPTI-MEM中。混合兩種溶液在室溫下孵育15分鐘。對于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允許稀釋的試劑和培養基孵育**少30分鐘可以增加3倍的效率。確保復合物在沒有血清的情況下形成。孵育15分鐘后，在復合物中加入含有血清的培養基（800μl）。（注意以上是35mm培養皿使用體積）。對于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA應該在與脂質體混合之前shou先與Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步驟允許在一個很小的體積下混合DNA和脂質體，接下來可以不需要換培養基的情況下直接加入。對于每一種脂質體的詳細的信息可以參考產品說明書。

14.我使用SF900 Ⅱ時，細胞生長良好，但是為什么我的蛋白產物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時效果好？

如果目的蛋白是一個后期蛋白，它將與蛋白酶一起表達，這些蛋白酶將會作用于目的蛋白。在加有血清的培養基中，這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白，從而使目的蛋白產品保持完好。在無血清配方中，蛋白酶作用的**底物是你的目的蛋白。為了避免這一問題，加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清（少于1％），讓血清給蛋白酶提供作用底物。#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#

15.如何檢測內毒素(熱源)水平？

LAL（Limulus Amebocyte Lysate）試驗是可用的**敏感和特異的檢測細菌內毒素的方法。Levin和Bang 發現細菌可引起鱟（Limulus polyphemus）血管內的凝集作用。內毒素啟動一個細胞內酶原系統（絲氨酸蛋白酶級聯反應系統），通過修飾凝集素，產生一種透明的膠，LAL中的凝固蛋白，從而，形成不可溶的基質。LAL試劑緩沖的鱟（血細胞）裂解物。
胎牛血清的內毒素檢測是在Grand Island，按照手冊上Gel-clot 方法進行的。在對血清產品進行內毒素檢測前，用無熱源的水1：10稀釋樣品。稀釋樣品沸水育5分鐘，以消除抑制劑。（通常，血液中的內毒素結合成份的出現會抑制凝膠過程，使內毒素不能與LAL反應。樣品預先熱處理可以消除這種抑制作用。）

16.我可以使用固體形式的Murashige Skog 培養基嗎？

如果使用固體形式的培養基，需要加入瓊脂。瓊脂加入前要先滅菌。應該避免MS培養基的直接滅菌，應該高壓滅菌瓊脂溶液，然后把融化的瓊脂溶液加入到MS培養基中。

17.20℃下配制的緩沖液，在較高或較低的溫度下PH值會改變嗎？
對于普通使用的緩沖液，PH值隨溫度變化而變化。
下表列出溫度改變10℃時，PH值的變化情況
例如 20℃下配制PH7.4 Tris緩沖液,40℃時PH值為 7.4-（2x0.310）＝6.78
緩沖系統 pKa/20℃ [Delta]pKa/10℃ 
Mes 6.15 -0.110
Ada 6.60 -0.110
Pipes 6.80 -0.085
Aces 6.90 -0.200
Bes 7.15 -0.160
Mops 7.20 -0.013
Tes 7.50 -0.200
Hepes 7.55 -0.140
Tricine 8.15 -0.210
Tris 8.30 -0.310
Bicine 8.35 -0.180
Glycylglycine 8.40 -0.280

18.室溫下(25℃)配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用時PH值是多少？

緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時，不同的PH值。
4℃ 25℃ 37℃ 
8.1 7.5 7.2
8.2 7.6 7.3
8.3 7.7 7.4
8.4 7.8 7.5
8.5 7.9 7.6
8.6 8.0 7.7
8.7 8.1 7.8
8.8 8.2 7.9
8.9 8.3 8.0
9.0 8.4 8.1
9.1 8.5 8.2
9.2 8.6 8.3
9.3 8.7 8.4
9.4 8.8 8.5

19.昆蟲細胞培養的**適PH值和滲透壓是多少？

生長培養基的PH值對細胞的增值和病毒或重組蛋白的生產均會產生影響。對于大部分鱗翅類昆蟲細胞系，在PH值 6.0－6.4范圍的大部分應用效果良好。培養鱗翅類昆蟲細胞系時，培養基的**適滲透壓是 345－380mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細胞培養方式，減少技術問題，保持PH值和滲透壓在以上所列的范圍之內。

20.High Five細胞有任何其它名稱嗎？

High Five細胞也被稱為Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。

21.PFHM-II 和HYBRIDOMA-SFM之間有什么差別？

PFHM-II (Protein-free Hybridoma Medium)是不包含有蛋白質的單克隆抗體生產培養基。如果作為雜交瘤生產培養基使用，PFHM-II可能需要補充低水平的血清。HYBRIDOMA-SFM即是雜交瘤生產培養基，也是單克隆抗體生產培養基。它包含低水平的蛋白質。

22.在High Five無血清培養基中去污劑的濃度是多少？

High Five無血清培養基中去污劑的濃度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。

23.High Five細胞用多大的密度凍存？

3.0x10E6 cells/ml

24.在我的果蠅培養基中發現形成白色沉淀，加熱后溶解。它是什么？對我的細胞有害嗎？

可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培養基中谷氨酰胺的濃度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的濃度比在RPMI 1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加難以溶解。沉淀也可能是不止一種成分的復合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起。只要沉淀在培養條件下可以溶解，對實驗不會有不利的影響。

25.如何從T25瓶中轉移sf9細胞？能用胰蛋白酶消化嗎？

我們強力推薦使用脫落細胞的方法，因為這項技術破壞性**小，生活力**高。正如手冊上所顯示，通過使用巴氏德吸液管，讓細胞上培養基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養瓶。只有在**必要的情況下，才使用胰酶消化細胞。
胰酶消化一個T25瓶的sf9細胞：
1. 去除培養基。
2. 用2ml 1xPBS（足以覆蓋細胞表面）洗滌細胞，去除PBS.
3. 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆蓋細胞表面）。
4. 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動。
5. 向細胞中加入2ml 細胞培養液，移入錐形管，用2ml培養液洗瓶壁，移入同一錐形管中。（培養基中的FBS終止了胰酶的活性。）
6. 離心（1100rpm）沉淀細胞。去除培養基。
7. 用新的培養基重新懸浮細胞。傳代。

26.在Sf9, Sf21, 和high Five細胞懸浮培養時，肝素的使用量是多少？

為了防止懸浮培養細胞聚集的形成，使用肝素濃度為10單位/毫升細胞懸液。

27.如何評估ES細胞合格的胎牛血清？

使用D3 ES細胞。這是一個對于胎牛血清中生長促進、生長抑制和分化因子非常敏感的細胞系。
相關生長效率分析：
當ES細胞以非常低的密度傳入包含10％胎牛血清的生長培養基中，檢測開始和支持ES細胞克隆的能力。
細胞毒分析：
當以非常低的密度傳入包含30％胎牛血清的生長培養基中，檢測ES細胞和feeder細胞的生長能力。
相關形態學和分化分析：#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
檢測胎牛血清支持未分化ES細胞克隆的能力。通過堿性磷酸酶活性評估分化程度。未分化的ES細胞小顏色深紅粉紅，分化的細胞較大，豐滿，顏色較淺。
所有的分析在沒有ESGRO的情況下進行的，培養基中出現ESGRO會掩蓋由胎牛血清所導致的問題。（ESGRO或LIF經常用來保持ES細胞處于未分化狀態。）
經過培養發現，大約8批中有1批可以用來培養ES細胞。

28.在重新凍存sf9細胞前，它可以傳多少代？隨著傳代的次數的增加，它的感染能力會降低嗎？

通常情況當細胞經過30次傳代后，應該返回凍存。無論什么時候記數時，都應該檢查細胞活力。如果超過95％的細胞保持有活力和在大約30小時左右加倍，細胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降，它們的感染力將不在是有效的。